研究背景

研究结果

1. 植入前小鼠ROSI胚胎中转录组、染色质可及性和DNA甲基化的概述

本研究中使用早期圆形精子细胞进行胞浆内注射，获得ROSI胚胎。之后进行单细胞RNA测序(scRNA-seq)，结果显示，圆形精子细胞为RS2期精子细胞，仍处于精子发生的早期阶段。随后证实，ROSI和卵胞浆内单精子注射 （ICSI）胚胎在受精时的发育进程基本上是同步的。ROSI和ICSI的微操作过程相似，只是所使用的单倍体雄性生殖细胞发育阶段不同。当胚胎构建在B6D2F1背景上时，也观察到类似的结果。早期圆形精子细胞不成熟的表观遗传学状态可能使它们在受精时对表观遗传重编程具有更强的抵抗力。ROSI和ICSI胚胎的所有活胎及其胎盘的重量都是差别不大的，此外，通过ROSI或ICSI获得的成年小鼠的体重和繁殖能力也没有区别，说明ROSI胚胎的发育缺陷处于一个相对狭窄的发育时间窗口内，如果胚胎克服了这一问题，则其后续的发育将相对正常。

多组学测序可以在单细胞分辨率下同时分析基因表达、DNA甲基化和染色质可及性。为了探索ROSI胚胎的表观遗传重编程信息，对ROSI胚胎的每个细胞进行单细胞多组学测序。本研究共纳入138个ROSI胚胎，90个ICSI胚胎作为对照，以消除胚胎微操作技术本身的影响，覆盖发育的6个关键阶段，以及包括精子、圆形精子细胞和中期卵母细胞在内的配子。结果显示，在ROSI胚胎着床前发育期间，DNA甲基化和染色质可及性的重编程均有所提示，但与ICSI胚胎相比仍表现出一定的变化，特别是在原核阶段。

如前所述，ROSI胚胎在受精后原核阶段发生的表观遗传重编程与ICSI对照相比有所不同;特别是ROSI胚胎的雄性原核阶段具有独特的表观遗传特征。ROSI胚胎存在母体到受精卵过渡相关基因的错误表达，并表现出染色质/细胞骨架组织缺陷。qPCR 结果提示，在ROSI胚胎中被下调的少量ZGA基因在染色质和细胞骨架组织过程中富集，这表明少量ZGA基因的错误表达可能与染色质/细胞骨架组织缺陷有关。之后对ICSI和ROSI胚胎的原核形态进行分析。结果提示，ROSI胚胎的雄性原核平均直径明显小于ICSI对照组，且该表型维持到PN5期。此外，在ROSI胚胎出现沉积，该沉积与多个染色质特征密切相关。

3.A366可提高ROSI胚胎的发育能力

基于单细胞多组学测序分析和实验数据，ROSI胚胎的重编程缺陷主要发生在原核期，表现为转录组和表观遗传修饰的改变。为了探索是否有此前未确定的小化合物可以通过靶向特定的表观遗传修饰来提高ROSI胚胎的发育潜力。作者筛选了一个由178个小化合物组成的文库，这些化合物针对表观遗传修饰，包括DNA甲基化和组蛋白修饰。基于ROSI胚胎的发育潜力，从三个方面评估了这些小化合物的最终效果:(i)对早期胚胎无毒，(ii)提高囊胚发育率，(iii)提高活产率。为了证实异常H3K9me2沉积和Ehmt2过度表达会带来那些表型，作者分析了敲低或过表达Ehmt2后ROSI胚胎的发育能力，结果提示，敲低Ehmt2可显著提高ROSI胚胎的囊胚率，相反，当Ehmt2过表达时，H3K9me2沉积增加ROSI胚胎囊胚率呈剂量依赖性下降。然而，Ehmt2过表达组同时使用A366对胚胎进行处理，则无法消除Ehmt2过表达对胚胎发育造成的阻滞。A366处理ROSI胚胎可使活产率提高约两倍。值得注意的是，经A366处理的ROSI胚胎的存活子代健康且可育。此外，经A366处理的体内受精卵的活产率与对照组相当，表明A366处理的安全性。总之，A366处理能显著提高小鼠ROSI胚胎的发育水平。

4.A366可以部分克服早期圆形精子细胞产生的ROSI胚胎的重编程缺陷

为了探索A366如何改善ROSI胚胎的发育潜力，对经A366处理的ROSI胚胎进行了单细胞多组学测序。对照组为未处理的ROSI胚胎和ICSI胚胎。根据基因表达谱对聚类细胞进行降维分析。发现ROSI和ICSI胚胎可以被分离成两个独立的细胞簇，说明这两种胚胎的转录组在PN5期已经表现出一定的差异。值得注意的是，A366处理可以改变ROSI胚胎的全局基因表达模式。然后使用DNA甲基化和染色质可及性数据进行细胞聚类。与转录组数据一致，A366处理的ROSI胚胎从男性和女性原核阶段都恢复到独立的细胞状态。这些数据与A366可以影响ROSI胚胎发育潜力的发现一致。